無菌室標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程與驗(yàn)收規(guī)范(含《潔凈室沉降菌測試標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》)

1.目的

　　本規(guī)程旨在為無菌操作及無菌室的保護(hù)提供一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程。

2.適用范圍

　　生測實(shí)驗(yàn)室

3.責(zé)任者

　　QC主管生測員

4.定義

　　無

5.安全注意事項(xiàng)

　　嚴(yán)格無菌操作，防止微生物污染；操作人員進(jìn)入無菌室應(yīng)先關(guān)掉紫外燈。

6.規(guī)程

　　6.1.無菌室應(yīng)設(shè)有無菌操作間和緩沖間，無菌操作間潔凈度應(yīng)達(dá)到10000級，室內(nèi)溫度保持在20-24℃，濕度保持在45-60%。超凈臺(tái)潔凈度應(yīng)達(dá)到100級。

　　6.2.無菌室應(yīng)保持清潔，嚴(yán)禁堆放雜物，以防污染。

　　6.3.嚴(yán)防一切滅菌器材和培養(yǎng)基污染，已污染者應(yīng)停止使用。

　　6.4.無菌室應(yīng)備有工作濃度的消毒液，如5％的甲酚溶液，70％的酒精，0.1％的新潔爾滅溶液，等等。

　　6.5.無菌室應(yīng)定期用適宜的消毒液滅菌清潔，以保證無菌室的潔凈度符合要求。

　　6.6.需要帶入無菌室使用的儀器，器械，平皿等一切物品，均應(yīng)包扎嚴(yán)密，并應(yīng)經(jīng)過適宜的方法滅菌。

　　6.7.工作人員進(jìn)入無菌室前，必須用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在緩沖間更換專用工作服，鞋，帽子，口罩和手套(或用70%的乙醇再次擦拭雙手)，方可進(jìn)入無菌室進(jìn)行操作。

　　6.8.無菌室使用前必須打開無菌室的紫外燈輻照滅菌30分鐘以上，并且同時(shí)打開超凈臺(tái)進(jìn)行吹風(fēng)。操作完畢，應(yīng)及時(shí)清理無菌室，再用紫外燈輻照滅菌20分鐘。

　　6.9.供試品在檢查前，應(yīng)保持外包裝完整，不得開啟，以防污染。檢查前，用70％的酒精棉球消毒外表面。

　　6.10.每次操作過程中，均應(yīng)做陰性對照，以檢查無菌操作的可靠性。

　　6 .11.吸取菌液時(shí)，必須用吸耳球吸取，切勿直接用口接觸吸管。

　　6.12.接種針每次使用前后，必須通過火焰灼燒滅菌，待冷卻后，方可接種培養(yǎng)物。

　　6.13.帶有菌液的吸管，試管，培養(yǎng)皿等器皿應(yīng)浸泡在盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內(nèi)消毒，24小時(shí)后取出沖洗。

　　6.14.如有菌液灑在桌上或地上，應(yīng)立即用5%石碳酸溶液或3％的來蘇爾傾覆在被污染處至少30分鐘，再做處理。工作衣帽等受到菌液污染時(shí)，應(yīng)立即脫去，高壓蒸汽滅菌后洗滌。

　　6.15.凡帶有活菌的物品，必須經(jīng)消毒后，才能在水龍頭下沖洗，嚴(yán)禁污染下水道。

　　6.16.無菌室應(yīng)每月檢查菌落數(shù)。在超凈工作臺(tái)開啟的狀態(tài)下，取內(nèi)徑90mm的無菌培養(yǎng)皿若干，無菌操作分別注入融化并冷卻至約45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，放至凝固后，倒置于30～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)，證明無菌后，取平板3～5個(gè)，分別放置工作位置的左中右等處，開蓋暴露30分鐘后，倒置于30～35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)，取出檢查。100級潔凈區(qū)平板雜菌數(shù)平均不得超過1個(gè)菌落，10000級潔凈室平均不得超過3個(gè)菌落。如超過限度，應(yīng)對無菌室進(jìn)行徹底消毒，直至重復(fù)檢查合乎要求為止。

7.參照

　　參照《藥品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法》 《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》中(無菌檢查法)章節(jié) 中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T0188.6-1995《藥品檢驗(yàn)操作規(guī)程》

8.分發(fā)部門

　　質(zhì)量管理部

無菌室技術(shù)指導(dǎo)說明

　　在獲得了無菌環(huán)境和無菌材料后，我們還要保持無菌狀態(tài)，才能對某種特定的已知微生物進(jìn)行研究或利用它們的功能，否則外界的各種微生物很容易混入。外界不相干的微生物混入的現(xiàn)象，在微生物學(xué)中我們叫做污染雜菌。防止污染是微生物學(xué)工作中十分關(guān)鍵的技術(shù)。一方面是徹底滅菌，另一方面防止污染，是無菌技術(shù)的兩個(gè)方面。另外，我們還要防止所研究的微生物，特別是致病微生物或經(jīng)過基因工程改造了的本來自然界不存在的微生物從我們的實(shí)驗(yàn)容器中逃逸到外界環(huán)境中去。為了這些目的，在微生物學(xué)中，有許多措施。

　　無菌室內(nèi)的地面、墻壁必須平整，不易藏污納垢，便于清洗。工作臺(tái)的臺(tái)面應(yīng)該處于水平狀態(tài)。無菌室和緩沖間都裝有紫外線燈，無菌室的紫外線燈距離工作臺(tái)面1米。工作人員進(jìn)入無菌室應(yīng)穿滅過菌的服裝，戴帽子。

　　當(dāng)前無菌室多存在于微生物工廠，一般實(shí)驗(yàn)室則使用超凈臺(tái)。超凈臺(tái)其主要功能是利用空氣層流裝置排除工作臺(tái)面上部包括微生物在內(nèi)的各種微小塵埃。通過電動(dòng)裝置使空氣通過高效過濾器具后進(jìn)入工作臺(tái)面，使臺(tái)面始終保持在流動(dòng)無菌空氣控制之下。而且在接近外部的一方有一道高速流動(dòng)的氣簾防止外部帶菌空氣進(jìn)入。

　　在條件較困難的地方，也可以用木制無菌箱代替超凈臺(tái)。無菌箱結(jié)構(gòu)簡單，便于移動(dòng)，箱正面開有兩個(gè)洞，不操作時(shí)用推拉式小門擋住，操作時(shí)可以將雙臂伸進(jìn)去。正面上部裝有玻璃，便于在內(nèi)部操作，箱內(nèi)部裝有紫外線燈，從側(cè)面小門可以放進(jìn)去器具和菌種等。

應(yīng)用

無菌操作技術(shù)當(dāng)前不僅在微生物學(xué)研究和應(yīng)用上起著舉足輕重的作用，而且在許多生物技術(shù)中也被廣泛應(yīng)用。例如轉(zhuǎn)基因技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)等。

潔凈室沉降菌測試標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1目的：建立潔凈室中沉降菌的測試標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，保證藥品在規(guī)定潔凈級別內(nèi)進(jìn)行生產(chǎn)。

2范圍：潔凈室的沉降菌的監(jiān)測。

3依據(jù)：國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16294-1996。

4職責(zé)：QA潔凈度監(jiān)測人員、微生物檢驗(yàn)人員對本制度的實(shí)施負(fù)責(zé)。

5內(nèi)容
5.1潔凈室：對塵粒及微生物污染規(guī)定需進(jìn)行環(huán)境控制的房間或區(qū)域。

5.2潔凈工作臺(tái)：一種工作臺(tái)或者與之類似的一個(gè)封閉圍擋工作區(qū)。其特點(diǎn)是自身能夠供給經(jīng)過過濾的空氣或氣體，如垂直層流潔凈罩、水平層流罩、垂直層流潔凈工作臺(tái)、水平層流潔凈工作臺(tái)、自凈器等。

5.3潔凈度：潔凈環(huán)境內(nèi)單位體積空氣中含大于或等于某一粒徑懸浮粒子的允許統(tǒng)計(jì)數(shù)。

5.4菌落：細(xì)菌培養(yǎng)后，由一個(gè)或幾個(gè)細(xì)菌繁殖而形成的一細(xì)菌集落，簡稱CFU。通常用個(gè)數(shù)表示。

5.5測試方法
5.5.1方法概述：本測試方法利用沉降法，即通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養(yǎng)基平皿，經(jīng)48小時(shí)以上培養(yǎng)，在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落數(shù)，來評定潔凈環(huán)境內(nèi)的活微生物數(shù)，并以此來評定潔凈室的潔凈度。
5.5.2所用的儀器和設(shè)備
5.5.2.1高壓消毒鍋：使用時(shí)參照文件GZ-ZL-SOP-066-00進(jìn)行操作。
5.5.2.2恒溫培養(yǎng)箱：必須定期對培養(yǎng)箱的溫度計(jì)進(jìn)行檢定。
5.5.2.3培養(yǎng)皿：一般采用中90mm×15mm硼硅酸玻璃培養(yǎng)皿。使用前將培養(yǎng)皿置于121℃濕熱滅菌20分鐘。
5.5.2.4培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基加熱熔化，冷卻至約45℃在無菌操作條
件下將培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿，每皿約15m1。待瓊脂培養(yǎng)基凝固后，將培養(yǎng)基平皿放入30～35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，若培養(yǎng)基平皿上確無菌落生長，即可供采樣用，制備好的培養(yǎng)基平皿應(yīng)在2～8℃的環(huán)境中存放。
5.5.3測試步驟
5.5.3.1采樣方法：將已制備好的培養(yǎng)皿放置在預(yù)先確定的取樣點(diǎn)，打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露0.5小時(shí)，再將培養(yǎng)皿蓋上蓋后倒置。
5.5.3.2培養(yǎng)：全部采樣結(jié)束，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在30～35℃培養(yǎng)，時(shí)間不少于48小時(shí)。每批培養(yǎng)基應(yīng)有對照試驗(yàn)，檢查培養(yǎng)基本身是否污染，可每批選定3只培養(yǎng)皿作對照培養(yǎng)。
5.5.3.3菌落計(jì)數(shù)：用肉眼直接計(jì)數(shù)，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。若培養(yǎng)皿上有2個(gè)或2個(gè)以上菌落重疊，可分辨時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上的菌落計(jì)數(shù)。

5.6注意事項(xiàng)
4.6.1測試用具要做滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性。
5.6.2采取一切措施防止人為對樣本的污染。
5.6.3對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細(xì)的記錄。
5.6.4由于細(xì)菌種類繁多，差別甚大，計(jì)數(shù)時(shí)一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細(xì)觀察，不要漏計(jì)培養(yǎng)皿邊緣生長的菌落，并須注意細(xì)菌菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時(shí)用顯微鏡鑒別。
5.6.5采樣前應(yīng)仔細(xì)檢查每個(gè)培養(yǎng)皿的質(zhì)量，如發(fā)現(xiàn)變質(zhì)、破損或污染的應(yīng)剔除。

5.7測試規(guī)則
5.7.1測試狀態(tài)
5.7.1.1沉降菌測試前：被測試潔凈室（區(qū)）的溫濕度須達(dá)到規(guī)定的要求，靜壓差、必須控制在規(guī)定值內(nèi)。被測試潔凈室（區(qū)）已消毒。
5.7.1.2測試狀態(tài)有靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種，并在報(bào)告中注明測試狀態(tài)。
5.7.1.3測試人員：測試人員必須穿戴符合環(huán)境潔凈度級別的工作服。靜態(tài)測試時(shí)，室內(nèi)測試人員不得多于2個(gè)人。
5.7.2測試時(shí)間
5.7.2.1對單向流，如100級凈化房間內(nèi)及層流工作臺(tái)，測試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行不少于10分鐘后開始。
5.7.2.2對非單向流，如10000級、100000級以上的凈化房間，測試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行不少于30分鐘開始。

5.8沉降菌計(jì)數(shù)
5.8.1最少采樣點(diǎn)數(shù)目：可按表1確定。在滿足最少測點(diǎn)數(shù)的同時(shí)，還宜滿足最少培養(yǎng)皿數(shù)，見表2。
表1最少采樣點(diǎn)數(shù)目
面積(m2)           潔凈度級別
            100  10000  100000  300000
＜10        2～3  2      2     2
≥10～＜20  4     2      2     2
≥20～＜40  8     2      2     2
≥40～＜100  16    4      2     2
≥100～＜200  40   10     3     3
注：表中的面積對于單向流潔凈室是指送風(fēng)面積，對于非單向流潔凈室是指房間面積。
表2最少培養(yǎng)皿數(shù)
潔凈度級別 所需Φ90mm培養(yǎng)皿數(shù)（以沉降0.5小時(shí)計(jì)）
  100             14
  10000            2
  100000           2
  300000           2
5.8.2采樣點(diǎn)的布置：工作區(qū)測試點(diǎn)位置離地0.8～1.5m左右（略高于工作面）?？稍陉P(guān)鍵設(shè)備或關(guān)鍵工作活動(dòng)范圍處增加測點(diǎn)，采樣點(diǎn)的布置應(yīng)力求均勻，避免采樣點(diǎn)在某 局部區(qū)域過于集中，某局部區(qū)域過于稀疏。
5.8.3記錄：測試報(bào)告中應(yīng)記錄房間溫度、相對濕度、壓差、測試狀態(tài)及測試數(shù)據(jù)。
5.8.4結(jié)果計(jì)算：用計(jì)數(shù)方法得出各個(gè)培養(yǎng)皿的菌落數(shù)。平均菌落數(shù)的計(jì)算見下式：
m1 m2 …… mn
平均菌落數(shù)m=n
式中：m為平均菌落數(shù)；m1為1號培養(yǎng)皿菌落數(shù)；m2為2號培養(yǎng)皿菌落數(shù)；mn為n號培養(yǎng)皿菌落數(shù)；n為培養(yǎng)皿總數(shù)。
5.8.5結(jié)果評定：用平均菌落數(shù)判斷潔凈室的空氣中的微生物。
5.8.6潔凈室（區(qū)）內(nèi)的平均菌落數(shù)必須低于所選定的評定標(biāo)準(zhǔn)（見表3）。
5.8.7若某潔凈室（區(qū)）的平均菌落數(shù)超過評定標(biāo)準(zhǔn)，則必須對此區(qū)域先行消毒，然后重新測試兩次，測試結(jié)果必須合格。
表3 
潔凈級別     100級   10000級   100000級   300000級
標(biāo)準(zhǔn)（平均）  1個(gè)/皿  3個(gè)/皿    10個(gè)/皿    15個(gè)/皿